mBio | 徐晓玲课题组发表了光合玫瑰菌3-羟基丙酸循环中关键双功能酶丙二酰辅酶A还原酶的结构和催化机制

第一作者：张鑫、辛吉瑀、王志国

通讯作者：徐晓玲

发表期刊：mBio

期刊 5-Year Impact Factor：7.786

通讯单位：杭州师范大学 基础医学院

论文DOI：https://doi.org/10.1128/mbio.03233-22

（一）研究背景

3-羟基丙酸（3-hydroxypropionate，3-HP）是一种重要的化学中间体，用来合成丙烯酸、丙二酸和1,3-丙二醇等众多平台化合物，被称为世界上最具开发潜力的化工产品之一。3-HP的化学合成能耗高、污染大、成本高、效率较低且副产品多。生物合成法制备3-HP逐渐成为国际上最瞩目的研究方向之一，如以谷物类碳水化合物生产3-HP，利用转基因工程菌转化甘油、丙酸等底物来生产3-HP等。然而，目前已研究过的十余种生物合成途径中，只有丝状不产氧光合细菌中存在的3-HP循环是唯一利用自养方式进行的，具有不可比拟的优势。3-HP循环是自然界6种二氧化碳固定途径中新发现的一类自养固碳途径，具有与其他传统固碳途径显著不同的鲜明特点：它是一个双循环偶联的代谢过程，通过两个循环充分利用产物和中间物；整个循环涉及19步化学反应，但只需13种酶完成催化，几个多功能酶构成一个简洁高效的催化体系，这在其他自养途径中并不常见。将催化3-HP循环前两步反应的关键酶——乙酰辅酶A羧化酶（ACCase）和丙二酰辅酶A还原酶（MCR）重组构建为丙二酰辅酶A途径，已在大肠杆菌、酵母等细胞中实现3-HP的生物合成。然而，由于这两个重组酶在细胞中表达水平和催化活性的不平衡，所有包含丙二酰辅酶A途径的细胞合成3-HP的产量都较低，严重制约了3-HP的生物合成及其工业应用。作为催化丙二酰辅酶A转化为3-HP的关键酶，MCR全长1229个氨基酸，其N端和C端结构域分别具有醇脱氢酶和醛脱氢酶的催化活性，在3-HP的合成中发挥至关重要的作用。然而，目前还没有关于MCR全长结构的报道，其N端与C端结构域之间通过何种方式连接，以及同源二聚体的拼装组合方式等都不清楚。此外，对MCR局部结构的研究依然无法阐明MCR整体的底物结合、催化和中间产物的转运机制，极大地限制了对MCR催化机理的理解及其在3-HP合成中的应用。

（二）成果简介

2023年6月6日，杭州师范大学基础医学院徐晓玲课题组在微生物领域权威期刊mBio（中科院升级版一区TOP期刊，IF=7.786）上在线发表了题为“Structural basis of a bi-functional malonyl-CoA reductase (MCR) from the photosynthetic green non-sulfur bacterium Roseiflexus castenholzii”的研究成果。文章首次报道了来自光合玫瑰菌Roseiflexus castenholzii全长MCR 3.35埃分辨率的冷冻电镜结构（图1），以及N和C端结构域（RfxMCR-N和RfxMCR-C）结合反应中间物NADP⁺和MSA的高分辨率晶体结构（图2）。研究发现，全长RfxMCR是由两个相互交叉的单体组成的同源二聚体，每个亚单位包含四个串联排列的短链脱氢酶/还原酶（SDR）结构域和一个额外的结构域（ED）组成。每个SDR结构域特征具有典型的Rossman折叠，由中心的七链平行β片夹着两个或三个α-螺旋组成。在同源二聚体的中心，发现了RfxMCR-N和RfxMCR- C连接处折叠形成2股反向平行的α-螺旋(G⁵⁷³WAESL⁵⁷⁸)。

全长丙二酰辅酶a还原酶(RfxMCR)的冷冻电镜结构

双功能丙二酰辅酶a还原酶(RfxMCR)的催化机制

通过对N端和C端结构域与反应中间物复合物的晶体结构、催化活性分析和全长MCR的分子动力学模拟，进一步揭示了双功能酶MCR选择底物、结合反应中间物和催化3-HP生成的分子机制（图3）。反应起始于RfxMCR的C端，NADPH烟酰胺基团的氢对丙二酰辅酶A的羰基C3原子发起亲核攻击，导致S-C键断裂，生成MSA、CoAS^-和NADP⁺。随后，CoAS^-通过Tyr743羟基和Arg746胍基进行去质子化;去质子化的Arg746又可以被周围的溶剂还原。在第二步还原反应中，中间产物丙二酸半醛（MSA）进入RfxMCR的N端，N端的Thr165通过与C3羰基氧形成氢键来稳定反应中间体MSA，随后NADPH烟酰胺基团的氢对MSA的C3原子发起亲核攻击，反应生成的MSA阴离子通过从Tyr178羟基上提取一个质子而被质子化，形成3-HP。总体来说，RfxMCR催化M-CoA生产MSA，随后MSA转化为3-HP，整个过程共完成2步还原反应，消耗2分子NADPH。此工作首次揭示了MCR全长的结构特征，为基于结构的酶改造及丙二酰辅酶A途径的合成生物学应用提供了理论依据，对3-HP的绿色合成具有重要的指导意义。

（三）作者简介

杭州师范大学为该论文的第一研究单位，2022级生物学博士生张鑫、讲师辛吉瑀和副教授王志国为共同第一作者，徐晓玲教授为通讯作者，该研究受国家自然科学基金和浙江省自然科学基金资助。

论文链接：https://journals.asm.org/doi/10.1128/mbio.03233-22