第一作者：辛吉瑀、闵真真、于璐、苑欣怡
通讯作者：徐晓玲
发表期刊：The Plant Cell
期刊5-Year Impact Factor：13.1
通讯单位：杭州师范大学 基础医学院
论文DOI：https://doi.org/10.1093/plcell/koae029
（一）成果简介
2024年1月31日，杭州师范大学徐晓玲教授课题组与中国科学院强磁场科学中心于璐副研究员在The Plant Cell期刊（中科院升级版一区TOP期刊）上合作发表了题为“Cryo-EM structure of HQNO-bound Alternative Complex III from the anoxygenic phototrophic bacterium Chloroflexus aurantiacus”的研究论文。文章解析了来自绿色非硫细菌Chloroflexus (C.) aurantiacus光合电子传递链的ACIII（CaACIIIp）在天然状态和结合甲基萘醌类似物2-heptyl-4-hydroxyquinoline-N-oxide (HQNO) 的冷冻电镜结构，并通过电子顺磁共振、光谱电化学、酶活测定和分子动力学模拟，揭示了CaACIIIp偶联氢醌氧化和电子传递的分子机制。
（二）引言
光合作用（Photosynthesis）和呼吸作用（Respiration）是地球碳氧循环的重要媒介，所产生的能量是生物界赖以生存的基础。基于化学渗透假说，光合和呼吸作用分别通过光合磷酸化和氧化磷酸化，利用氢醌：电子受体氧化还原酶偶联电子的传递和质子的跨膜转运，所产生的跨膜质子动力势驱动ATP的合成。作为光合和呼吸电子传递链共有的组分，细胞色素（cytochrome，cyt）b6f和cyt bc1复合物（也称为复合物III）在偶联电子传递和质子跨膜转运中发挥着不可或缺的作用。
近年来，一种全新的电子载体蛋白复合体——替代复合体III（Alternative Complex III，ACIII）在多种微生物的光合和呼吸电子传递链中被发现。尽管这个复合体的组成和结构都与cyt bc1/b6f完全不同，却在光合和呼吸电子传递链中发挥着相似的氢醌：电子受体氧化还原酶的功能。目前仅有来自Flavobacterium (F.) johnsoniae、Rhodothermus (R.) marinus呼吸链和Roseiflexus (R.) castenholzii光合电子传递链的ACIII结构被解析。这些ACIIIs都包含6个核心亚基（ActA，-B，-C，-D，-E，-F），其中ActA、C、D和F的23段跨膜螺旋构成跨膜区。在膜周质侧，ActA和ActE分别结合5个和1个c型血红素（Heme-c），ActB结合4个铁硫簇（1个[3Fe-4S]和3个[4Fe-4S]）用于传递电子。10次跨膜亚基ActC含有一个潜在的醌结合位点和一条质子转运通道；而ActF尽管含有一条质子转运通道，却没有潜在的醌结合口袋。尽管这些工作解析了ACIII的亚基组成和空间结构，但都没有发现结合的醌分子或底物类似物，使得醌结合位点的位置和构象，以及ACIII偶联氢醌氧化和电子传递的机制缺乏实验证据的支持。
（三）图文导读
继2020年在Science Advances期刊报道R. castenholzii光合电子传递链ACIII氧化态和还原态的电镜结构和偶联机制后，研究人员从C. aurantiacus中分离获得天然状态的CaACIIIp，通过冷冻电镜单颗粒方法解析了其2.9-Å分辨率的结构。在此结构中，首次获得了ActG和一个新亚基I的构象（图1A，B）。ActG亚基由单股跨膜螺旋（α1）和膜周质侧的两个螺旋（α2和α3）组成，在膜周质侧与ActA和ActE亚基的血红素结合区域形成广泛的氢键和盐桥；亚基I只含有一个跨膜螺旋，在胞质侧与ActC和ActD相互作用（图1C）。特别的是，ActG的α2占据了ActE缺失的C末端序列的位置，在一定程度上维持了复合体的稳定性（图1D）。
紧接着，研究人员获得了结合HQNO的CaACIIIp在2.7-Å分辨率的电镜结构，首次明确了醌结合口袋的精确位置和构象（图1E，F）。结构显示，HQNO结合在由Trp84, Ile88, Pro138, Ile175和Leu168组成的口袋中，头部的喹啉环与His141和Asp171通过氢键相互作用。His141和Asp171在天然和HQNO结合状态下发生了明显的构象改变，说明这两个氨基酸残基在氢醌的氧化中起到关键作用（图1F）。而ActC质子转运通道中间三个高度保守的氨基酸（His99，His246和Arg394）与HQNO结合口袋之间存在着广泛的氢键网络，在偶联氢醌氧化和质子跨膜转运中发挥着重要作用（图1G）。尽管ActF与ActC具有相似的结构和潜在质子转运通道，但没有发现结合醌分子的口袋，很可能由于缺乏氢醌氧化所产生的驱动力而无法转运质子。
图1 天然状态和HQNO结合状态下CaACIIIp的电镜结构。
与中国科学技术大学的田长麟教授和于璐副研究员合作，研究人员通过电子顺磁共振、氧化还原电势、光谱和酶活测定，明确了CaACIIIp氧化氢醌时释放出的电子沿着[3Fe-4S]和6个c型血红素传递给下游的两个电子受体金色蓝素Auracyanin (Ac)-A和Ac-B（图2A，B）。为了回答CaACIIIp对两种电子受体Ac-A和Ac-B的偏好性这个长久以来存在争议的问题，研究人员通过分子动力学模拟发现：Ac-A和Ac-B都通过静电相互作用与CaACIIIp的Heme_E结合口袋接触，使得电子从Heme_E直接传递到Ac-A/B结合的铜离子（图2C，D）。然而，Ac-B在铜离子结合域边缘分布着一些中性氨基酸残基，与ActE亚基中一段特殊的Insertion loop形成更广泛的疏水相互作用，从而赋予Ac-B相对较低的结合自由能。因此，CaACIIIp与下游电子受体Ac-B具有形成更稳定的瞬态电子
传递配合物的结构特征。
图2 CaACIIIp发挥氢醌：金色蓝素（Auracyanin，Ac）氧化还原酶活性的结构基础。
这项工作首次报道了ACIII结合醌类似物的结构，发现了两个新的亚基ActG和I在维持复合物稳定中所发挥的作用，并揭示了ACIII偶联氢醌氧化和电子传递的结构基础。这些研究结果扩展了对ACIIIs结构多样性和分子进化的认识，为研究醌：电子受体氧化还原酶的偶联机制和细菌能量代谢提供了理论基础。
（四）作者简介
辛吉瑀 |
闵真真 |
苑欣怡 |
杭州师范大学讲师辛吉瑀、已毕业硕士闵真真、中国科学院合肥物质院强磁场中心副研究员于璐和杭州师范大学博士生苑欣怡为共同第一作者，徐晓玲教授为论文通讯作者，杭州师范大学为第一通讯单位。杭州师范大学讲师吴文萍、博士生张鑫和吴婧怡、已毕业硕士何慧敏、副研究员辛越勇，美国华盛顿大学Robert E. Blankenship教授，中国科学技术大学田长麟教授等人参与了本文的研究工作。本研究得到了国家自然科学基金、国家重点研发计划、中国科学院战略性先导科技专项、中国科学院青促会项目、浙江省自然科学基金杰出青年项目、稳态强磁场实验装置（SHMFF）和浙江大学冷冻电镜中心的共同支持。
通讯作者：徐晓玲 （课题组网站http://bms.hznu.edu.cn/xuxllab/）
徐晓玲，教授，博士生导师，清华大学博士，美国Scripps研究所博士后，入选浙江省高层次人才特殊支持计划青年拔尖人才、“院士结对培养青年英才”、杭州市首届“西湖学者”等。综合运用生物化学、生物物理和合成生物学方法，研究细胞能量代谢过程中重要生物大分子的结构和功能，开展以结构为基础的蛋白质分子设计，探索其在生物固碳、绿色化工和医药领域的应用。近年来在Science Advances、Nature Communications、eLife、mBio等期刊发表研究论文30余篇，主持国家自然科学基金项目4项，浙江省自然科学基金杰出青年项目等多项课题。
论文链接：
https://academic.oup.com/plcell/advance-article/doi/10.1093/plcell/koae029/7595673
