第一作者：张鑫、辛吉瑀、王志国
通讯作者：徐晓玲
发表期刊：mBio
期刊 5-Year Impact Factor：7.786
通讯单位：杭州师范大学 基础医学院
论文DOI：https://doi.org/10.1128/mbio.03233-22
（一）成果简介
2023年6月6日，杭州师范大学基础医学院徐晓玲课题组在微生物学领域权威期刊mBio（中科院升级版一区TOP期刊）上在线发表了题为“Structural basis of a bi-functional malonyl-CoA reductase (MCR) from the photosynthetic green non-sulfur bacterium Roseiflexus castenholzii”的研究成果。文章首次报道了来自光合玫瑰菌Roseiflexus castenholzii全长MCR（RfxMCR）3.35埃分辨率的冷冻电镜结构，及其N和C端结构域结合辅因子NADP+和中间产物丙二酸半醛（MSA）在2.0埃和2.3埃分辨率的X-射线晶体结构，并结合分子动力学(MD)模拟和酶促分析阐明了这个双功能酶的催化机理。
（二）引言
3-羟基丙酸（3-hydroxypropionate，3-HP）是一种重要的化学中间体，用来合成丙烯酸、丙二酸和1,3-丙二醇等众多平台化合物，被称为世界上最具开发潜力的化工产品之一。3-HP的化学合成能耗高、污染大、成本高、效率较低且副产品多。生物合成法制备3-HP逐渐成为国际上最瞩目的研究方向之一，如以谷物类碳水化合物生产3-HP，利用转基因工程菌转化甘油、丙酸等底物来生产3-HP等。然而，目前已研究过的十余种生物合成途径中，只有丝状不产氧光合细菌中存在的3-HP循环是唯一利用自养方式进行的，具有不可比拟的优势。3-HP循环是自然界6种二氧化碳固定途径中新发现的一类自养途径，具有与其他传统固碳途径显著不同的鲜明特点：它是一个双循环偶联的代谢过程，通过两个循环充分利用产物和中间物；整个循环涉及19步化学反应，但只需13种酶完成催化，几个多功能酶构成一个简洁高效的催化体系，这在其他自养途径中并不常见。
将催化3-HP循环前两步反应的关键酶——乙酰辅酶A羧化酶（ACCase）和丙二酰辅酶A还原酶（MCR）重组构建为丙二酰辅酶A途径，已在大肠杆菌、酵母等细胞中实现3-HP的生物合成。然而，由于这两个重组酶在细胞中表达水平和催化活性的不平衡，所有包含丙二酰辅酶A途径的细胞合成3-HP的产量都较低，严重制约了3-HP的生物合成及其工业应用。作为催化丙二酰辅酶A转化为3-HP的关键酶，MCR全长1229个氨基酸，理论分子量为135 kD。MCR的N端和C端结构域分别具有醇脱氢酶和醛脱氢酶的催化活性，在3-HP的合成中发挥着关键催化作用。然而，目前全长MCR结构还没有被报道，其N端与C端结构域之间通过何种方式连接，生理状态下同源二聚体的拼装组合方式等都不清楚。此外，对MCR局部结构的研究依然无法阐明MCR整体的底物结合、催化和中间产物的转运机制，极大地限制了对MCR催化机理的理解及其在3-HP生物合成中的应用。
（三）图文导读
图1 全长丙二酰辅酶A还原酶（RfxMCR）的冷冻电镜结构
研究发现，全长RfxMCR是由两个相互交叉的单体组成的同源二聚体，每个亚单位包含四个串联排列的短链脱氢酶/还原酶（SDR）结构域和一个额外的结构域（ED）组成。每个SDR结构域由七个平行的β折叠和两侧围绕的α-螺旋结构组成典型的Rossman折叠构象。在同源二聚体的交叉处，发现了N端和C端结构域连接处折叠形成两股反向平行的α-螺旋（G573WAESL578），推翻了此前关于MCR同源二聚体以相同方向排列的假设模型。
图2 丙二酰辅酶A还原酶N端和C端结合辅因子和中间产物的高分辨率晶体结构、催化位点的构象变化和活性测定
研究人员进一步采用X射线衍射方法分别解析了结合NADP+-MSA的RfxMCR N端（SDR1-2）和C端（SDR3-ED-4）结构域的晶体结构，通过与全长RfxMCR结构的比较分析，揭示了底物结合过程中催化位点的构象变化。RfxMCR-N在结合中间产物 NADP+和MSA后，SDR1 中α10螺旋（Ser213-Gly228）向底物结合口袋旋转约20º，覆盖MSA和NADP+的烟酰胺环。这导致MSA结合位点闭合并使底物结合口袋收缩，α10螺旋的显著构象变化是在结合反应中间体MSA时发生的特定结构特征。类似地，在NADP+-MSA结合过程中，RfxMCR-C的底物结合口袋也发生了侧链构象变化。当NADP+-MSA结合时，SDR3催化三联体成员（Ser731-Lys753-Tyr749）朝着底物结合口袋移动，与NADP+和MSA形成氢键。Arg799的鸟嘌呤侧链翻转约1.6 Å以稳定MSA的羰基基团，Asp651和Arg616的侧链分别移动约2.0 Å和4.1 Å固定NADP+的腺苷环，使得RfxMCR-C中腺苷环结合位点发生闭合。
图3 双功能丙二酰辅酶A还原酶催化丙二酰辅酶A生成3-羟基丙酸的分子机制
综合对N端和C端结构域与反应中间物高分辨率的晶体结构、催化活性分析和全长MCR的分子动力学模拟，研究人员揭示了双功能酶RfxMCR选择底物、结合反应中间物和催化3-HP生成的分子机制。双功能MCR的两步连续催化反应起始于RfxMCR的C端，NADPH烟酰胺基团的氢对丙二酰辅酶A（M-CoA）的羰基C3原子发起亲核攻击，导致S-C键断裂，生成MSA、CoAS-和NADP+。随后，CoAS-通过Tyr743羟基和Arg746胍基进行去质子化; 去质子化的Arg746可以被周围的溶剂还原。在第二步还原反应中，中间产物丙二酸半醛（MSA）进入RfxMCR的N端，N端的Thr165通过与C3羰基氧形成氢键来稳定反应中间体MSA，随后NADPH烟酰胺基团的氢对MSA的C3原子发起亲核攻击，反应生成的MSA阴离子通过从Tyr178羟基上提取一个质子而被质子化，形成3-HP。
总体来说，RfxMCR催化M-CoA生产MSA，随后MSA转化为3-HP，整个过程共完成2步还原反应，消耗2分子NADPH。此工作首次揭示了MCR全长的结构特征和催化机制，为基于结构的酶改造、丙二酰辅酶A途径的合成生物学应用提供了理论依据，对3-HP的绿色合成具有重要的指导意义。
（四）作者简介
第一作者：2022级生物学博士生张鑫（后排左一）、青年教师辛吉瑀（前排右三）和副教授王志国为共同第一作者。
通讯作者：徐晓玲
徐晓玲（前排左四），教授，博士生导师，清华大学博士，美国Scripps研究所博士后，入选浙江省特殊支持计划青年拔尖人才、“院士结对培养青年英才”、杭州市首届“西湖学者”等。综合运用生物化学、生物物理和合成生物学方法，研究细胞能量代谢过程中重要生物大分子的结构和功能，开展以结构为基础的蛋白质分子设计，探索其在生物固碳、绿色化工和医药领域的应用。近年来在Science Advances、Nature Communications等期刊发表研究论文30余篇，承担国家自然科学基金项目4项，浙江省自然科学基金杰出青年项目等多项课题。
论文链接：https://journals.asm.org/doi/10.1128/mbio.03233-22
