第一作者： 李申、高天问、郝万山
通讯作者： 程凯莹
发表期刊： Cellular and Molecular Life Sciences
期刊5-Year Impact Factor： 7.9
通讯单位： 杭州师范大学
论文DOI： https://doi.org/10.1007/s00018-026-06346-3
成果简介
近日，杭州师范大学基础医学院程凯莹教授课题组在国际学术期刊Cellular and Molecular Life Sciences发表题为“Structural and biochemical characterization of a novel DinG containing an endonuclease domain”的研究论文。该研究以大芬戈尔德菌（Finegoldia magna）来源的DinG蛋白（FmaDinG）为研究对象，首次对具有N-端核酸内切酶结构域的DinG亚群（EndoDinG）进行了系统的结构与生化功能表征。
研究发现，FmaDinG同时具有偏好Mn²⁺的DNA核酸内切酶活性和ATP依赖的5′–3′方向DNA解旋活性。研究团队解析了FmaDinG与单链DNA及ATP非水解类似物ADPNP形成的复合物晶体结构，分辨率达到2.26 Å，并通过酶学分析与定点突变实验，揭示了其N-端核酸酶结构域、Arch结构域及解旋酶核心在DNA结合和加工中的重要作用。
结合结构与生化证据，研究团队提出了FmaDinG通过DNA解旋与核酸切割协同发挥作用的分子模型，为理解DinG家族蛋白的功能多样性及细菌DNA加工机制提供了新的结构依据。
引言
DNA的解旋与切割是细胞基因组维护过程中的重要分子事件。DinG样蛋白属于XPD家族SF2超家族解旋酶，广泛存在于细菌中，通常利用ATP水解释放的能量沿单链DNA以5′–3′方向移动，并参与多种DNA代谢过程。尽管这类蛋白具有相对保守的解旋酶核心，其结构域组成和生物学功能却表现出明显的多样性。
近年来，研究人员发现部分DinG蛋白还融合了具有核酸切割功能的额外结构域。其中，一类被称为EndoDinG的蛋白在N-端含有PD-(D/E)XK型核酸酶结构域，但这一结构域是否真正具有核酸内切酶活性，以及核酸酶与解旋酶功能如何相互协调，仍缺乏系统研究。围绕这些问题，研究团队选取FmaDinG作为代表蛋白，开展了晶体结构解析、DNA底物切割、解旋活性测定及关键位点突变等实验。
成果亮点
1. FmaDinG具有保守的解旋酶核心和独特的N-端核酸酶结构域
研究团队首先利用失去核酸酶活性的FmaDinG D75A突变体，与单链DNA及ADPNP形成稳定复合物，成功解析了其2.26 Å分辨率的晶体结构。结构显示，FmaDinG除包含XPD家族蛋白保守的两个RecA样运动结构域（MD1和MD2）、Arch结构域及铁硫簇结合结构域（FeS）外，还具有一个额外的N-端核酸酶结构域。
在该复合物中，单链DNA沿MD1与MD2之间的沟槽结合，ADPNP则位于两个运动结构域之间的核苷酸结合位点。这些结构特征为理解FmaDinG识别DNA及利用ATP驱动核酸转位提供了直接依据（图1）。
图1 FmaDinG–ssDNA–ADPNP复合物的整体结构及DNA结合位点。
2. N-端核酸酶结构域赋予FmaDinG独特的DNA内切活性
为了明确N-端结构域的催化功能，团队对不同末端标记和末端封闭的单链DNA底物进行了切割实验。结果发现，FmaDinG能够产生不同长度的DNA切割产物，且末端封闭并未阻断其切割过程，证明该蛋白主要表现为核酸内切酶而非定向外切酶。
金属离子依赖性实验显示，Mn²⁺最有利于其核酸酶活性；序列偏好性分析则发现，该酶对不同碱基组成的DNA具有明显的切割差异，表现为dA＞dC＞dT＞dG。与单链RNA相比，FmaDinG对单链DNA具有更高的切割效率。
进一步的结构分析显示，FmaDinG的N-端结构域具有典型的PD-(D/E)XK型核酸酶折叠。H40、E54、R73、D75、E88和K90等位点的突变显著削弱核酸酶活性，表明这些残基参与催化或底物识别。此外，基于AlphaFold3预测模型的构象比较提示，N-端α1螺旋可能在DNA结合过程中转变为环状结构，从而打开允许DNA进入催化中心的“门控”通道（图2）。
图2 FmaDinG核酸酶结构域的结构特征、底物偏好及关键催化位点分析。
3. 解旋酶与核酸内切酶协同促进DNA加工
研究团队进一步通过实时荧光解旋实验发现，FmaDinG具有ATP依赖的5′–3′方向DNA解旋活性，能够作用于带有5′单链DNA尾部的多种底物，其中对5′突出末端底物表现出较高的解旋效率。结构分析还发现，Arch结构域的部分残基可直接参与DNA结合，为认识该结构域在DinG家族蛋白DNA加工过程中的作用提供了新的证据。值得注意的是，当反应体系中加入ATP后，FmaDinG能够将切割范围进一步延伸至DNA双链区域，产生更短的降解产物；而ATP酶活性受损的D378A突变体则无法有效完成这一过程。对DNA结合相关残基进行突变同样导致底物加工效率下降，说明ATP驱动的DNA转位与核酸切割密切相关（图3）。
图3 FmaDinG的DNA解旋活性及ATP依赖的核酸酶–解旋酶功能协同。
综合以上结果，团队提出FmaDinG的协同工作模型：N端核酸酶结构域首先对具有3′游离末端的DNA底物进行初步切割，随后MD1和MD2运动结构域依赖ATP沿DNA的5′–3′方向转位，逐步将DNA引导至核酸酶催化中心，使切割进一步深入双链区域。与具有3′–5′外切酶活性的ExoDinG不同，EndoDinG可能采用“核酸内切酶切割＋5′–3′解旋转位”的独特DNA加工方式（图4）。
图4 FmaDinG作为核酸酶–解旋酶协同机器加工DNA的作用模型。
小结
本研究结合蛋白质晶体结构解析、生化活性测定、结构预测与定点突变分析，首次系统揭示了EndoDinG亚群代表性蛋白FmaDinG的结构组成和双重酶学功能，阐明了N-端核酸内切酶结构域、解旋酶核心及Arch结构域在DNA识别、解旋与切割中的协同作用。拓展了对DinG样解旋酶家族功能演化和分子机制的认识，为进一步探索相关蛋白在细菌基因组稳定性维持及DNA损伤应答中的潜在作用提供了研究基础。FmaDinG在细胞内的具体生理底物与生物学功能仍有待后续验证。
本研究得到浙江省医学表观遗传重点实验室支持，获国家自然科学基金、杭州市青年创新团队项目和杭州师范大学科研创新团队项目资助。
作者简介
第一作者 李申
杭州师范大学基础医学院博士后。2025年博士毕业于中山大学，随后入职杭州师范大学。主要以生物化学，结构生物学以及微生物学为研究手段，研究噬菌体与细菌之间的互作机制。以第一作者身份发表SCI论文6篇。
共同第一作者 高天问
杭州师范大学2023级硕士研究生，生物化学与分子生物学专业，以第一作者或共同第一作者在mBio、Cell Mol Life Sc发表SCI论文。已毕业。
共同第一作者 郝万山
杭州师范大学2024级博士研究生，生物化学与分子生物学专业，以共同第一作者在Nucleic Acids Research、mBio、Cell Mol Life Sci发表SCI论文。
通讯作者 程凯莹
杭州师范大学基础医学院教授，博士生导师。2016年于浙江大学获博士学位，随后于帝国理工学院从事博士后研究，2021年初入职杭州师范大学。目前主要研究方向是细菌的DNA复制及损伤修复机制，主要涉及相关通路上核酸酶、解旋酶、聚合酶等酶类的生物学功能、生化活性及蛋白结构研究。已在Nature Structural & Molecular Biology、Nucleic Acids Research、elife，Cell Mol Life Sci、mBio、BMC biology等SCI期刊发表相关论文30余篇，主持多项国家自然科学基金、省自然科学基金和杭州市青年创新团队项目。
